LEZIONI DI MICROSCOPIA: apertura numerica e risoluzione, mezzi di immersione

L'apertura numerica dell'obiettivo di un microscopio è la misura della sua capacità di raccogliere luce e di risolvere i dettagli del campione a una certa distanza. Le onde luminose che formano l'immagine passano attraverso il campione ed entrano nell'obiettivo in un cono invertito 

 La luce bianca consiste in un ampio spettro di onde elettromagnetiche, le cui lunghezze d'onda variano tra 400 e 700 nanometri; 1 millimetro equivale a 1000 micron e 1 micron equivale a 1000 nm. La luce di colore verde ha un intervallo di lunghezze d'onda a 550 nm, che corrisponde a 0,55 micron. Quando visualizzo al microscopio un oggetto piccolo, la luce incidente viene diffratta in modo che si discosti dalla direzione originale (Figura 1 (a)). Più piccolo è l'oggetto, più pronunciata sarà la diffrazione dei raggi luminosi incidenti. Valori più alti di apertura numerica consentono a raggi sempre più obliqui di entrare nella lente frontale dell'obiettivo, che produce un'immagine più altamente risolta e consente di visualizzare strutture più piccole con maggiore chiarezza.

Un semplice sistema di microscopia è costituito da un obiettivo e un campione illuminato da un fascio di luce collimato, che è il caso in cui non viene usato il condensatore. La luce diffratta dal campione è presentata come un cono invertito di mezzo angolo (α), che rappresenta i limiti di luce che possono entrare nell'obiettivo. Per aumentare l'apertura effettiva e il potere di risoluzione del microscopio, viene aggiunto un condensatore (Figura 1 (b)) per generare un cono di raggio sul lato di illuminazione del campione. Ciò consente all'obiettivo di raccogliere fasci di luce che sono il risultato di più ampi angoli di diffrazione, aumentando la risoluzione del sistema microscopico. La somma degli angoli di apertura dell'obiettivo e del condensatore viene definita apertura di lavoro. Quando l'angolo di apertura del condensatore è uguale a quello dell'obiettivo, si ottiene la risoluzione massima.

Per poter confrontare due obiettivi e ottenere un controllo quantitativo sulla risoluzione, l'apertura numerica (o la misura dell'angolo solido coperto da un obiettivo) è definita come:

Apertura numerica (NA) = η • sin (α)             (1)

dove α è uguale alla metà dell'angolo di apertura dell'obiettivo e η è l'indice di rifrazione del mezzo di immersione utilizzato tra l'obiettivo e il vetrino protettivo che protegge il campione (η = 1 per l'aria; η = 1.51 per l'olio o il vetro). Esaminando l'equazione (1), è evidente che l'indice di rifrazione è il fattore condizionante nel raggiungere aperture numeriche superiori a 1,0.  Sin(90°)=1 il che suggerisce che l'apertura numerica è limitata non solo dall'apertura angolare, ma anche dall'indice di rifrazione del mezzo. In pratica, gli angoli di apertura superiori a 70-80 gradi si trovano solo negli obiettivi più performanti (che in genere costano migliaia di dollari).

La risoluzione di un microscopio ottico è definita come la distanza più piccola tra due punti su un campione che può ancora essere distinto come due entità separate. La risoluzione è direttamente correlata all'amplificazione utile del microscopio e al limite di percezione del dettaglio del campione, sebbene sia un valore alquanto soggettivo in microscopia perché ad alto ingrandimento, un'immagine può apparire sfuocata ma deve ancora essere risolta alla massima capacità del microscopio. obiettivo e assistenza componenti ottici. A causa della natura ondulatoria della luce e della diffrazione associata a questi fenomeni, la risoluzione di un obiettivo del microscopio è determinata dall'angolo delle onde luminose in grado di entrare nella lente frontale e pertanto si dice che lo strumento sia diffrazionalmente limitato.


Gli osservatori perderanno le sfumature nell'immagine se l'obiettivo proietta sul piano dell'immagine dettagli più piccoli del potere risolutivo dell'occhio umano (situazione tipica a bassi ingrandimenti e aperture numeriche elevate). Il fenomeno dell'ingrandimento vuoto si verifica se un'immagine viene ingrandita oltre il potere risolutivo fisico delle immagini. Per questi motivi, l'ingrandimento utile per l'osservatore dovrebbe essere superiore a 500 volte l'apertura numerica dell'obiettivo, ma inferiore a 1.000 volte l'apertura numerica.