Spettroscopia di Dicroismo Circolare

Dicroismo Lineare e Circolare

Il fenomeno del dicroismo circolare (CD) si osserva nelle molecole chirali in quanto assorbono diversamente la luce polarizzata circolarmente a destra rispetto a quella polarizzata circolarmente  a sinistra.  

Per la legge di Lambert Beer:

                                                A=εlc

ad una specifica lunghezza d'onda, fissata la lunghezza del percorso ottico, l'assorbimento è funzione direttamente proporzionale alla concentrazione del mezzo.

La luce linearmente polarizzata può essere vettorialmente scomposta in luce circolarmente polarizzata a destra e luce circolarmente polarizzata a sinistra, uguali in intensità e lunghezza d'onda (nell'immagine sottostante, la figura a sinistra):

Il vettore somma dei due vettori ruota ( si parla di rotazione ottica OR)  quando le due precedenti intensità, anzicchè essere uguali, variano. Questo fenomeno di dicroismo lineare (LD) avviene in alcuni materiali anisotropi, come alcuni cristalli naturali (sopra, figura a destra).

Se la molecola da analizzare è un isomero speculare, le luci circolarmente polarizzate destrorsa e sinistrorsa vengono assorbite diversamente, a causa della differente disposizione delle due strutture chirali.  Per generare luce polarizzata circolarmente nella strumentazione spettrofotometrica analitica, una delle componenti del fascio viene ritardata di 90º rispetto all'altra grazie ad un modulatore fotoelastico, il PEM. Quando i due raggi  sfasati di 90º vengono sommati, il risultato è una luce polarizzata circolarmente in una direzione; invertendo i due assi alternati, si genera luce polarizzata circolarmente nell'altra direzione. Questa luce interagisce con il campione in esame: nelle molecole chirali, per la loro specifica struttura la luce circolarmente polarizzata viaggia a velocità differente a seconda che ruoti verso destra o verso sinistra. Nella scansione del range delle lunghezze d'onda, vengono misurati ellitticità e dispersione, utili a comprendere la struttura, cioè la geometria chimica dell'analita:

Vantaggi : 

• bassa quantità di campioni richiesta (200ml di soluzione 0.5 mg/ml in acqua o tampone ), 
• tecnica non-distruttiva (si può recuperare il materiale). 
• si possono osservare effetti di ambienti diversi sulla struttura (pH, agenti caotropici denaturanti, soventi organici , temperatura,....)

Svantaggi : 

• interferenza da parte dell'ambiente se costituito da solventi che assorbono nella regione dell'UV
• misure possibili solo con campioni molto diluiti.
• fornisce informazioni qualitativi sul contenuto di struttura 2°, ma non dove si trova nella struttura 3°.

Preparazione dei campioni e misurazioni

• Additivi, tamponi e agenti stabilizzanti: Generalmente i polipeptidi vengono disciolti in tampone fosfato a 5 mM, sufficiente per mantenere il pH neutro ma con bassa assorbanza nell'UV. Qualunque composto nella soluzione che assorba nella regione 250 - 190 nm deve essere evitato poichè maschera il segnale
• Soluzione:  Deve quindi contenere solo quei composti necessari alla stabilità delle molecole da analizzare (se necessari) e alla concentrazione più bassa possibile. Il composto da analizzare deve essere il più puro possibile.
• Misurazioni:  Gli esperimenti iniziali servono per trovare le condizioni ottimali per l'esperimento reale. Cellette di quarzo di 0.2 - 0.5 mm sono un buon punto di partenza. Si eseguono per primi spettri dell'aria e del tampone senza il campione per controllo. Nel J600 Si osserva il segnale del voltaggio sul moltiplicatore. Questo aumenta se la soluzione assorbe per compensare alla perdità di luce trasmessa. Si deve evitare che il voltaggio salga al di sopra di 800V.
• Concentrazione del campione: deve essere nota con precisione e non superare i 0.5 mg/ml per i polipeptidi (20-40 µM)
• Setting dello strumento: da 190 -250nm per polipeptidi, scanzione di 0.5nm/s, band width 1 nm, accumulo di almeno tre scansioni

Acquisizione dei dati

• La differenza in assorbimento fra luce polarizzata a destra e sinistra è generalmente è molto bassa ma può essere accuratamente misurata.
   Il parametro che viene misurato dallo strumento è θ che indica l'ellitticità. θ può essere derivato da una semplice equazione empirica dalla differenza di assorbimento della luce circolarmente polarizzata (cioè dalla differenza nei coefficenti di estinzione delle due componenti circolarmente polarizzate, Δε)
  θ = 3300Δε
  Lo strumento misura  θ ad ogni lunghezza d'onda e produce un dicrogramma o spettro CD, dove sono plottati l'elitticità (in milli° o mdeg) contro la lunghezza  d'onda (λ) in nm.  Siccome ad alcune lunghezze d'onda viene assorbita più la luce polarizzata circolarmente a sinistra di quella a destra, ma ad altre vice versa, θ può avere valori positivi o negativi.  
  
  
  Per quanto riguarda i polipeptidi, mostrano degli spettri CD caratteristici per i diversi tipi di struttura 2^a. Ricercatori sono riusciti ad ottenere spettri di base per strutture 2^e "pure" (cioè specifiche per la struttura):
  Gli spettri delle proteine sono composti dalla somma ponderata di tutti i contributi derivanti dai diversi elementi di struttura secondaria che sono presenti e la loro relativa abbondanza. Da questi spettri, conoscendo gli spettri di base, è possibile la deconvoluzione dello spettro reale nei suoi componenti, e quindi stimare la percentuale di ogni tipo di struttura presente nella proteina. Qui sotto ci sono esempi di spettri CD per quattro proteine con diversi contenuti in α-elica, β-foglietto e turn.