Principi della spettroscopia Raman ( dal sito JASCO https://www.jasco-global.com/principle/2-features-of-raman-spectoscopy)

 

Che cos'è l'effetto Raman?

La spettroscopia Raman è una tecnica diffusa per l'analisi della struttura molecolare ed è considerata complementare alla spettroscopia infrarossa. La spettroscopia Raman si basa sull'effetto Raman, identificato per la prima volta dal fisico indiano Chandrasekhara Venkata Raman nel 1928. L'effetto Raman si basa sulla diffusione della luce, che include sia la diffusione elastica (Rayleigh) alla stessa lunghezza d'onda della luce incidente, sia la diffusione anelastica (Raman) a diverse lunghezze d'onda, dovuta alle vibrazioni molecolari. La diffusione Raman è circa un milione di volte meno intensa della diffusione Rayleigh. Pertanto, per ottenere spettri Raman, è necessario evitare che la diffusione Rayleigh prevalga sulla più debole diffusione Raman.

Fig. 1 Vibrazioni molecolari e diffusione Raman

Gli spettri Raman vengono misurati eccitando un campione con un raggio laser ad alta intensità, e la luce diffusa risultante viene fatta passare attraverso uno spettrometro. Lo spostamento Raman è la differenza di energia tra la luce incidente e quella diffusa. Nello spettro risultante, l'asse verticale rappresenta l'intensità della luce diffusa e l'asse orizzontale il numero d'onda dello spostamento Raman (cm -1 ).

Cos'è lo spostamento Raman?

Lo spostamento Raman è associato a due diverse bande di energia. Lo spostamento a lunghezze d'onda superiori a quella della luce incidente è definito scattering di Stokes. Lo spostamento a lunghezze d'onda inferiori a quella della luce incidente è definito scattering anti-Stokes. A titolo di esempio, lo spettro Raman del tetraclorometano misurato con una lunghezza d'onda di eccitazione di 532 nm (laser verde) è mostrato in Fig. 2. Lo scattering di Stokes si osserva nella regione a numero d'onda inferiore (lunghezza d'onda maggiore) e lo scattering anti-Stokes nella regione a numero d'onda superiore (lunghezza d'onda minore). Tipicamente, per l'analisi vengono utilizzati picchi di scattering di Stokes di intensità maggiore, ma possono essere utilizzati anche picchi anti-Stokes.

Fig. 2 Spettro Raman del tetraclorometano

Differenza tra spettroscopia Raman e spettroscopia IR

Sia la spettroscopia Raman che la spettroscopia IR si basano sulle vibrazioni molecolari, come illustrato di seguito. La spettroscopia infrarossa si basa sull'assorbimento dell'energia luminosa corrispondente all'energia vibrazionale delle molecole. La spettroscopia Raman si basa sulla diffusione della luce incidente a un'energia spostata dell'energia vibrazionale ( hν ) della molecola. I modi di vibrazione per gli stessi gruppi funzionali vengono osservati allo stesso numero d'onda.

Fig. 3 Livello di energia di vibrazione

Sebbene entrambe siano forme di spettroscopia vibrazionale, la spettroscopia IR e la spettroscopia Raman differiscono per alcuni aspetti fondamentali, come mostrato in Figura 4. La spettroscopia IR si basa sul fatto che l'assorbimento molecolare a specifiche frequenze vibrazionali causa una variazione del momento di dipolo. La spettroscopia Raman si basa sulla variazione della polarizzabilità di una molecola alle frequenze (spostamento Raman) alle quali la molecola diffonde la radiazione. La spettroscopia IR è sensibile alle vibrazioni dei gruppi funzionali eteronucleari e ai legami polari, in particolare allo stiramento degli atomi di OH in acqua. La spettroscopia Raman è sensibile ai legami molecolari omonucleari come i legami CC, C=C e C≡C.

Fig. 4 Bande di assorbimento IR (in alto) vs. spostamento Raman (in basso) per gruppi funzionali

Un confronto tra gli spettri di trasmissione IR e Raman per il polietilene tereftalato (PET) è mostrato in Figura 5. Gli spettri IR e Raman differiscono per il tipo di fenomeno fisico che possono misurare. Nelle misurazioni IR, l'intensità spettrale dipende dall'entità del momento di dipolo per i modi di vibrazione di legami come C=O e OH. D'altra parte, nella spettroscopia Raman, l'intensità dipende dal grado di polarizzabilità (volume elettronico) per i modi di vibrazione di legami come SS, CC e CN.

Fig. 5 Confronto tra spettri IR e Raman

Vantaggi del campionamento Raman
La spettroscopia Raman offre una serie di vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche spettroscopiche o di microscopia ottica. Può essere utilizzata per la profilazione della profondità e la mappatura microscopica dell'area dei campioni con una risoluzione spaziale di circa 1 μm. Le fibre ottiche con sonde remote possono essere utilizzate per analisi in situ sensibili. Senza combinazioni o armoniche, gli spettri Raman presentano meno "confusione". La tecnica non è sensibile alla presenza di acqua, vapore o gas ambientale. L'intervallo di misura non è limitato da componenti ottici, celle o accessori. Un intero spettro può essere misurato simultaneamente in un ampio intervallo da 4.000 a 50 cm -1 (o anche meno) utilizzando uno spettrometro con un rivelatore CCD. Le misurazioni possono essere eseguite su campioni opachi o torbidi e direttamente attraverso contenitori di vetro o plastica, semplificando notevolmente la preparazione del campione.

Vantaggi della microscopia Raman
La microscopia Raman è una tecnica senza contatto e non distruttiva che richiede una preparazione del campione minima o nulla. I campioni possono essere misurati con una risoluzione spaziale fino a 1 μm e la profilazione della profondità può essere facilmente eseguita anche su campioni trasparenti. Utilizzando la microscopia confocale, la misurazione può essere effettuata nella direzione Z per campioni trasparenti, fornendo un'immagine chimica tridimensionale del campione. Ci sono diversi fattori importanti da considerare quando si eseguono misurazioni Raman, che hanno un'influenza significativa sulla qualità dei dati ottenuti. Qui, forniremo alcuni spunti su come eseguire buone misurazioni Raman, cosa ci si può aspettare dallo strumento e gli elementi chiave che influenzano le prestazioni.

La spettroscopia Raman può essere utilizzata in un'ampia gamma di applicazioni, come mostrato nella Tabella 1. Tra queste rientrano non solo le tradizionali analisi quantitative/qualitative, ma anche applicazioni microscopiche che coinvolgono tecniche di imaging scalabili a seconda delle proprietà dei campioni target.

Tabella 1 Applicazioni Raman

Campo	Applicazioni
Prodotti farmaceutici	Stabilità alla luce delle compresse di ciprofloxacina, compresse di derivati ​​della xantina, compresse antibatteriche derivate da chinoloni, idrati di teofillina, anidridi, polimorfi cristallini di indometacina, polimorfi cristallini di carbamazepina (CBZ), polimorfi cristallini di ampicillina, struttura cristallina e stabilità termica dell'acido acetilsalicilico (aspirina), principi attivi nelle sostanze farmaceutiche e loro preparazione (Farmacopea giapponese), valutazione qualitativa/quantitativa degli additivi (Farmacopea giapponese), nastro di broncodilatatore (TBR, turobuterolo)
Cibo	Distribuzione dei componenti sulla superficie del cioccolato bianco, imaging dell'emulsione burro/margarina, componenti del tuorlo d'uovo, variazione termica del trealosio diidrato, acidi grassi nell'olio alimentare, soluzioni di acadidi (saccarosio, glucosio, xilitolo, galattosio, lattosio), pellicole multistrato per imballaggi alimentari, etanolo in bottiglie di vetro, caffeina, cristallinità delle bottiglie in PET
Materiali in carbonio	Nanotubi di carbonio, carbonio simile al diamante, fullereni
Semiconduttori	Dispositivi a semiconduttore di potenza (SiC), cristallinità del polisilicio
Dispositivi elettronici	Sostanze estranee nei substrati a cristalli liquidi, sostanze estranee nei filtri colorati, carbonio simile al diamante sulle superfici dei dischi rigidi, celle solari (silicio cristallino, silicio amorfo)
composti polimerici	Imaging 3D di nastro di cellophane, pellicole multistrato in polipropilene-polietilene, corpi estranei su pellicole in polietilene, additivi polimerici, dispersione in polimeri miscelati, cristallizzazione di polimeri fusi, polimerizzazione di resina polimerizzabile con UV, dispersione di lubrificante su pellicole, orientamento di gomma naturale, gomma sintetica
Materiali biologici	Visualizzazione della struttura delle isole marine in polimeri misti, cambiamenti strutturali nelle proteine ​​(emoglobina, lisozima, citocromo c), enzimi (ribonucleasi A), adesivo dentale, collagene, imaging chimico del corallo, valutazione della struttura e dell'orientamento della seta di ragno
Cosmetici	Ingredienti di segni di rossetto, ombretto
Gas	Idrati di gas naturale
Altri	Imaging di polvere da bagno (campioni di polvere mista), nanotubi di carbonio, cristallinità del nucleo delle matite, identificazione delle impronte digitali con inchiostro vermiglio, ruggine di ferro, fibre colorate, fibre di nylon 6, legno (lignina), quarzo, calcite, analisi non distruttiva di materiale archeologico (principalmente pigmenti)

L'imaging Raman è una tecnica potente che fornisce informazioni spaziali 3D e identificazione chimica (Fig. 6). Campioni con dimensioni che vanno dai micrometri ai millimetri possono essere analizzati in pochi minuti. JASCO ha sviluppato una tecnologia chiamata QRI che aumenta la velocità di acquisizione dei dati fino a 50 volte rispetto alla mappatura convenzionale e offre anche un notevole miglioramento della sensibilità.

Fig. 6 Imaging Raman per la distribuzione spaziale e l'identificazione chimica

Selezione della lunghezza d'onda del laser

La selezione della lunghezza d'onda del laser è importante per ottenere dati Raman significativi. La lunghezza d'onda di eccitazione può essere selezionata dall'UV al visibile fino al vicino infrarosso, con una gamma di opzioni di potenza a seconda dell'applicazione. Spesso è possibile installare più laser con diverse lunghezze d'onda in un microscopio Raman per consentire la misurazione dei dati per diversi tipi di campioni. Una lunghezza d'onda laser popolare è 532 nm perché offre un'energia di eccitazione Raman relativamente elevata e una bassa intensità di fluorescenza.
Tuttavia, per una maggiore riduzione della fluorescenza, vengono spesso utilizzati laser con lunghezze d'onda maggiori come 785 nm e 1064 nm. I laser UV, meno frequentemente richiesti, offrono l'ulteriore vantaggio del "Raman di risonanza", una scelta eccellente per i materiali carboniosi.

Fig. 7 Selezione del laser per la spettroscopia Raman

La fluorescenza può essere un effetto collaterale nelle misurazioni Raman e può avere origine sia dalle molecole bersaglio che dalla matrice circostante. È necessario prestare attenzione se il campione è contenuto in una fiala o in una provetta, poiché anche questo può causare interferenze di fondo. Esistono due metodi fisici per ridurre la fluorescenza. Il primo consiste nel selezionare una lunghezza d'onda laser alla quale non si verifichi fluorescenza. Si tratta in genere di una lunghezza d'onda maggiore, in cui l'energia per l'eccitazione degli elettroni è insufficiente. Il secondo metodo consiste nello scegliere la dimensione e la forma dell'apertura per mascherare il più possibile la matrice del campione ed eliminare la fluorescenza della matrice: questa funzionalità è migliorata dalla doppia filtrazione spaziale (DSF) inclusa negli spettrofotometri NRS-5000/7000. Una terza opzione è l'utilizzo di un algoritmo di reiezione della fluorescenza (brevettato), altamente efficace nel rimuovere lo spettro di fluorescenza più ampio, lasciando i picchi Raman più nitidi con una linea di base pulita, come mostrato di seguito. Questa funzione può essere utilizzata automaticamente durante la misurazione per un imaging rapido, oppure dopo l'acquisizione per un'ulteriore elaborazione dei dati. Questa soluzione spesso funziona bene per campioni con forte fluorescenza quando si utilizzano laser a lunghezza d'onda più corta (come 405 o 457 nm), che producono un segnale Raman più intenso.

Fig. 8 La correzione della fluorescenza può essere eseguita durante o dopo l'acquisizione

Risoluzione spettrale

La risoluzione spettrale in un sistema di microscopio Raman è definita da diversi fattori: la lunghezza focale dello spettrografo, il numero di linee sul reticolo e la risoluzione degli elementi nel rivelatore. La lunghezza focale è la distanza tra lo specchio di focalizzazione e il rivelatore, con una lunghezza focale maggiore che fornisce una risoluzione maggiore. Il reticolo è un componente ottico costituito da scanalature periodiche con un angolo specifico (angolo di blaze) per adattarsi alla lunghezza d'onda del laser di eccitazione. La risoluzione aumenta con l'aumentare del numero di scanalature. La specifica è tipicamente descritta dal numero di linee o scanalature per millimetro sulla superficie (un reticolo comune è di 900 gr/mm) e dalla lunghezza d'onda di blaze. A causa di limitazioni fisiche, non è possibile aumentare indefinitamente il numero di scanalature per aumentare la risoluzione spettrale. La luce che colpisce la superficie del reticolo viene dispersa secondo il principio di Huygens-Fresnel. L'ultimo fattore che influenza la risoluzione spettrale è la dimensione dei pixel nel rivelatore CCD, con pixel più piccoli che determinano una maggiore risoluzione spettrale.

Fig. 9 Schema che mostra la dipendenza della dispersione dalla lunghezza focale

Fig. 10 Dispersione angolare

Rilevatore CCD

Un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) è il rivelatore più comunemente utilizzato nella microscopia Raman. Si tratta di un rivelatore di fotoni ad alta sensibilità, la cui immagine viene costruita a partire dai segnali raccolti dai pixel, piccole regioni sensibili distinte sulla superficie del rivelatore. Pixel più piccoli offrono una maggiore risoluzione spettrale, ma questo deve essere valutato in rapporto a una sensibilità leggermente ridotta. Vengono utilizzati anche rivelatori a moltiplicazione di elettroni (EMCCD), che offrono una sensibilità fino a 50 volte superiore a quella dei rivelatori CCD convenzionali. Per le misurazioni nel vicino infrarosso, i rivelatori CCD non sono sufficientemente sensibili, quindi vengono utilizzati rivelatori a matrice di InGaAs.

Nella microscopia Raman, la risoluzione spaziale è estremamente importante per consentire la discriminazione di piccole differenze strutturali in un campione. Le lenti dell'obiettivo del microscopio ottico (fino a 100 ingrandimenti) vengono utilizzate per osservare il campione e trasmettere la luce Raman diffusa allo spettrografo. Ciò significa che molti dei fattori e delle tecniche che influenzano la microscopia ottica possono essere applicati alla microscopia Raman. La risoluzione spaziale è vincolata dal potere risolutivo della lente dell'obiettivo. Quando una luce con una distribuzione di energia costante viene introdotta nella lente dell'obiettivo, si verifica un pattern di diffrazione come mostrato in Fig. 11. L'area centrale luminosa è chiamata disco di Airy e il suo diametro (d) può essere determinato dalla lunghezza d'onda (l) e dall'apertura numerica (NA) (vedere l'equazione in Fig. 11). Il termine "d" si riferisce al limite di diffrazione che determina la risoluzione spaziale di una lente ottica.

Fig. 11 Disco di Airy risultante dalla diffrazione con un'apertura circolare

Fig. 12 Risoluzione spaziale definita dal criterio di Rayleigh

La definizione di risoluzione spaziale (criterio di Rayleigh, Fig. 12) nel piano XY si basa sulla distanza tra due punti vicini che possono essere distinti. Nella configurazione standard di un NRS-5000/7000 (laser a 532 nm, con obiettivo x100 con NA = 0,90), la dimensione dello spot laser al limite di diffrazione è calcolata come d = 720 nm. La risoluzione spaziale, secondo il criterio di Rayleigh, è quindi pari a 360 nm.
Come suggerisce l'equazione in Fig. 11, se la lunghezza d'onda del laser diminuisce, la risoluzione spaziale aumenta. Inoltre, se si utilizza un obiettivo a immersione in olio che fornisce una NA maggiore, è possibile ottenere un miglioramento della risoluzione spaziale.
Tuttavia, è necessario riconoscere anche la definizione basata sulla FWHM (larghezza totale a metà massimo) dell'intensità dell'anello di interferenza.

Ottica confocale JASCO DSF (Dual Spatial Filtration): La dimensione dello spot nella microscopia Raman laser è in genere inferiore a 1 μm. Il design confocale ottimizzato dell'NRS-5000/7000 include una caratteristica aggiuntiva: la doppia filtrazione spaziale (DSF), che consente di ottenere la massima risoluzione spaziale. La DSF elimina la luce parassita che non viene rimossa alla prima apertura e migliora significativamente la risoluzione lungo l'asse Z (Fig. 7).

Fig. 13

 a) Ottica confocale standard con apertura a foro stenopeico;

 b) Ottica confocale JASCO DSF (Dual Spatial Filtration)